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超分辨率荧光显微成像技术对拟南芥核中 RNA polymerase II 富集状态分析

发布日期: 2023-02-02

 RNA polymeraseII(RNAPII)负责大多数真核生物蛋白编码基因的转录。分析RNAPII的拓扑分布和定量有助于理解其在细胞间期的功能。以前的研究表明,RNAPII分子在分化的拟南芥核的异染色质中形成网状结构,而不是像在哺乳动物核中观察到的那样组织在不同的 "转录工厂 "中。 

通过结构化照明显微镜(SIM)获得的图像堆栈的最大强度投影中基于特定抗体标记的免疫信号强度测量表明内多倍体植物核中RNAPII的相对比例增加。本研究中应用光活化定位显微镜(PALM)来确定分化的拟南芥核中活性和非活性RNAPII分子的绝对数量和分布。在内多倍体化过程中RNAPII的比例增加得到证实,同时也证明了PALM的测量在定量方面比基于SIM的测量更可靠。单分子定位结果表明,虽然RNAPII分子在植物常染色质内全局分散,但它们也像哺乳动物转录工厂所描述的那样在较小的距离内聚集。

《Abundance and distribution of RNA polymerase II in Arabidopsis interphase nuclei》

01研究结果(节选)

1、结合SIM和PALM对拟南芥核中RNAPII进行超分辨率成像

大多数真核基因由RNAPII转录,细胞核中活性RNAPII的数量反映了转录的程度。电子和光学显微镜证明了转录本和RNAPII的共定位。根据其在基因上的位置和转录阶段,RNAPII被不同程度地磷酸化,而无活性的RNAPII主要是未磷酸化的。在哺乳动物中,RNAPII被认为是组织在不同的所谓 "转录工厂 "中,研究发现,转录工厂的直径和其中RNAPII分子的个数的高变异性不仅是由分析的不同细胞类型引起的,而且是由应用的不同成像方法引起的,而超分辨率显微成像技术,如结构化照明显微镜(SIM)和光活化定位显微镜(PALM),以超出光的衍射极限的高精度定位单个分子,可以更可靠地计数细胞中的分子。

细胞核被标记针对活性和非活性RNAPII的特异性抗体,结合应用SIM与3D-PALM。在SIM图像中确定RNAPII酶的分布后,网状结构变得可见。通过3D-PALM以记录单个闪烁分子的数量和定位。当分子被渲染到获得的定位精度时,除了缺乏RNAPII的核仁,活性和非活性 RNAPII分子均匀分布在整个细胞核中。SIM与PALM的组合以及不同RNAPII分子与同一细胞核中荧光团 Alexa488 和 Cy5 的同时标记允许单个分子定位在网状结构内。没有出现活性和非活性RNAPII的共定位,表明这两种分子在常染色质内占据不同的区域。

图1. 拟南芥叶核中RNAPII分子的分布

2、使用3D-PALM对RNAPII分子分布情况进行分析

超分辨率显微镜还可以评估生物标本的第三维,本研究中首次通过应用3D-PALM确定了分化的内多倍体植物细胞核中RNAPII分子的数量。由于存在更多分子,活性RNAPII显示出比非活性更高的全局密度。这两种RNAPII都表现出相似的聚集行为,并且规律出现高积累位点。对于活性和非活性RNAPII,小簇内单个RNAPII分子之间的距离在20nm和40nm之间。对于活性和非活性RNAPII,存在小簇之间进一步积累的区域。因此,除了常染色质内两种RNAPII分子的全局分散外,RNAPII分子也可能在两个不同的水平上聚集。尽管平均单分子距离为27nm,但活性RNAPII分子比非活性分子更密集地聚集在小距离和大距离簇中。大小簇对应于已知的动物转录工厂的大小。

图2. 由3D-PALM记录的8C拟南芥核中非活性和活性RNAPII分子的分布

图3. 活性RNAPII(Ser2ph)的分布和聚集情况

3、RNAPII分子的数量与内多倍体的关系

研究者利用3D-PALM还估计了整个细胞核内活性和非活性RNAPII的拷贝数。在分化的2C和内多倍体4C-16C叶核中,活性RNAPII(Ser2ph)的平均数量增加,范围在2C中的~13000和16C中的~58000之间。然而,在核内复制过程中精确酶复制的情况下,分子数量并未如理论上所预期的那样按比例增加。

图4. 2C–16C核中活性RNAPII(Ser2ph)的平均数

4、一种内多倍体植物间期细胞核的组织模型

先前的研究结果表明,染色体结构维持凝聚蛋白(SMC)和凝聚蛋白复合亚基SMC3和CAP-D3,分别在分化的内多倍体拟南芥核常染色质内显示出类似于 RNAPII的网状分布。基于此,研究者提出了一个模型(图5):两个不同的相邻染色体臂区域(蓝色和白色),异染色质高度浓缩。姐妹染色单体的常染色质由约50kb的染色质片段组成,这些片段进一步聚集。姐妹染色单体片段可以是内聚的或分开的。染色质纤维可能发源于RNAPII分子聚集的地方,并在潜在的转录工厂中被激活。无活性的RNAPII分子,大部分也聚集分布在常染色质内。SMC3和CAP-D3亚基均匀分布,可能负责维持灵活的常染色质组织。

图5. RNAPII和SMC蛋白复合物亚基(SMC3和CAP-D3)在间期植物核常染色质内的排列模型

02研究总结

1.由不同的RNAPII形成的网状结构,包含一些主要全局分散的单分子,它们可能聚集成已知的动物“转录工厂”的尺寸;
2.通过3D-PALM定量RNAPII比SIM图像堆栈生成的最大强度投影的信号强度测量更可靠;
3.3D-PALM测量证实RNAPII分子的数量随着内多倍体的程度增加。

参考文献

References

1.Schubert, Veit, and Klaus Weisshart. "Abundance and distribution of RNA polymerase II in Arabidopsis interphase nuclei." Journal of experimental botany 66.6 (2015): 1687-1698.

在本研究中,研究者主要借助3D-PALM超分辨率显微镜来研究RNAPII,3D-PALM与3D-STORM原理相似,目前在国内,随机光学重建显微镜STORM已成功实现商用,有需要STORM成像技术进行实验研究的专家老师们,请文末填写问卷即可预约获得 iSTORM 超高分辨率显微成像系统试拍服务~

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